- Caratterizzazione di genomi virali mediante spettrometria di massa MALDI-TOF in nanovescicole sieriche e urinarie isolate da pazienti sottoposti a trapianto renale
- Characterisation of viral genomes by MALDI-TOF mass spectrometry in serum and urinary nanovescicles isolated from patients undergoing renal transplantation
- Cristalli, Carlotta Pia <1988>
Subject
- MED/14 Nefrologia
Description
- Gli esosomi, vescicole nanometriche rilasciate dalla maggior parte delle cellule presenti nei vari fluidi biologici, possono trasferire il loro carico di proteine e acidi nucleici alle cellule riceventi. Scopo del presente studio è stato quello di valutare la presenza di genomi virali,appartenenti alle famiglie dei PyVs e degli HPV, associati a NV (NV) in 72 pazienti sottoposti a trapianto renale, in campioni di sangue e urina L’individuazione dei genomi virali è stata effettuata mediante spettrometria di massa MALDI- TOF. consentendo la contemporanea rilevazione dei 18 genomi virali per i PyV e dei 16 HPV per ciascun campione sottoposto ad analisi. Nei soggetti reclutati, donatori e riceventi, è stato effettuato inizialmente l’isolamento delle NV in campioni di siero e urina utilizzando una metodica di precipitazione basata sul polietilenglicole (PEG). La determinazione del numero e delle dimensioni delle NV isolate è stata effettuata mediante NTA. La conseguente determinazione degli epitopi esosomiali e nano vescicolari supercifiali è stata condotta mediante metodica MACSplex. L’arricchimento nelle NV urinarie della frazione esoosmiale è emerso grazie all’elevata presenza dell’antigene CD9 sulla superficie delle NV stesse. Inoltre, l’utilizzo della digestione enzimatica mediata da DNAsi I ha permesso di testare quanto potesse essere aspecifica la rilevazione dei genomi virali identificati con la spettrometria di massa, qualora si palesassero delle copurificazioni inattese. L’analisi dei genomi virali è stata così condotta in parallelo testando i medesimi campioni trattati con DNAsi I e non. I risultati ottenuti sulla corte dei soggetti donatori e dei pazienti trapiantati hanno messo in luce, delle percentuali di positività spiccate per il genoma virale del BKV (60%) e del JCV (20%) nelle NV sieriche ma soprattutto in quelle urinarie (50% entrambi).
- Advances in surgical techniques and the evolution of immunosuppressive therapy have undoubtedly improved survival rates, but post-transplant infections continue to cause morbidity and mortality in these patients. Exosomes, nanometric vesicles released by most of the cells present in the various biological fluids, can transfer their load of proteins and nucleic acids to the receiving cells. The aim of this study was to evaluate the presence of viral genomes, belonging to the families of PyVs and HPVs, associated with nanovescicles, in 72 patients undergoing renal transplantation, in samples of blood and urine. The identification of viral genomes was carried out through the development of a high-throughput method based on mass spectrometry MALDI- TOF. The method allowed the simultaneous detection of 18 viral genomes for PyV and 16 HPV for each sample tested. The isolation of the NV was initially carried out using a precipitation method based on PEG. The number and size of the isolated NV was determined by NTAs. The determination of exosomal epitopes was performed by the MACSplex method. The enrichment of the exosomial fraction in the urinary NVs was revealed by the high presence of the CD9 antigen on the surface of the NVs themselves. Moreover, the use of enzymatic digestion allowed to test how unspecific the detection of viral genomes identified with mass spectrometry could be, in case of unexpected copurifications. The results obtained on the transplanted patients have shown marked positive percentages for the viral genome of BKV (60%) and JCV (20%) in serum NV but especially in urinary ones (50% both). In conclusion, the investigation carried out in this project has led to the identification of the combination of isolation by immunomagnetic separation and enzyme treatment with DNAase I as the best method for the determination of viral genomes contained within exosomes (.i.e. SV12).
Date
- 2019-04-05
Type
- Doctoral Thesis
- PeerReviewed
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:unibo-25306
Cristalli, Carlotta Pia (2019) Caratterizzazione di genomi virali mediante spettrometria di massa MALDI-TOF in nanovescicole sieriche e urinarie isolate da pazienti sottoposti a trapianto renale, [Dissertation thesis], Alma Mater Studiorum Università di Bologna. Dottorato di ricerca in Scienze cardio nefro toraciche