- Ruolo del gene umano CYYR1: dallo studio funzionale dell'ortologo in Danio rerio alla potenziale implicazione in processi tumorigenici
- Role of the human CYYR1 gene: from the functional study of the Danio rerio ortholog to the potential implication in tumorigenic processes
- Pizzetti, Fabrizio <1988>
Subject
- BIO/13 Biologia applicata
Description
- Il locus CYYR1 identificato e clonato sul cromosoma 21 umano è stato caratterizzato dal punto di vista molecolare come un sistema multitrascritto, esclusivo dei vertebrati che ad oggi è orfano di una funzione specifica. Dati presenti in lettura e rintracciati mostrano una possibile relazione tra il gene CYYR1 e il pathway di Sonic Hedgehog (SHH). In questo progetto di tesi è stato utilizzato il modello animale Danio rerio per indagare il ruolo funzionale dell’ortologo (cyyr1), attraverso esperimenti di gain e loss of function che hanno permesso di dimostrare un suo coinvolgimento nello sviluppo del sistema nervoso centrale, del cuore e del tessuto muscolare. Lo studio dell’ortologo in zebrafish è stato associato all’utilizzo di linee cellulari di rabdomiosarcoma umano. I risultati ottenuti dall’induzione al differenziamento miogenico di queste linee, insieme ai dati ottenuti in Danio rerio, confermano il possibile coinvolgimento del gene CYYR1 nella miogenesi. Lo studio delle relazione tra il pathway di SHH e l’espressione del gene CYYR1 è stato condotto in entrambi i modelli con l’utilizzo di differenti inibitori della via di segnalazione. I risultati ottenuti mostrano che sistemi inibitori agenti direttamente sul recettore SMO riducono l’espressione del gene. Un dato inaspettato in Danio rerio ottenuto durante questi esperimenti di inibizione, ha aperto una nuova linea di ricerca in collaborazione con l’Università di Warwick tesa a verificare la relazione tra il gene cyyr1 e il gene lefty1. Gli esperimenti condotti presso il laboratorio della Prof.ssa Sampath hanno dimostrato la localizzazione del prodotto proteico cyyr1 in Danio rerio e indagato co-localizzazioni con la proteina lefty1. Infine, in collaborazione con Dr. Deflorian e della Prof.ssa Pistocchi, è stato generato un mutante di Danio rerio deleto per il gene cyyr1 con la tecnica CRISPR/Cas9. La caratterizzazione del mutante cyyr1 -/- ha confermato alcuni dei dati ottenuti attraverso esperimenti di loss of function.
- CYYR1 (Cysteine/tyrosine-rich 1) cloned on HC21 defines a new family of highly conserved vertebrate-specific genes. The human locus is characterized by a multitranscript-system including alternative spliced isoforms and one ncRNA gene overlapped in antisense orientation. To date, the function of the CYYR1 product is still unknown even if original results suggest the need of further investigations in order to verify a putative role of CYYR1 in the tumorigenic process of rhabdomyosarcoma, caused by dysfunction of cell differentiation. We perform a full characterization of cyyr1 expression and function in zebrafish model; the gene is present in single copy and the predicted protein maintains almost 58% of identity with human protein. A broad expression in central nervous system (CNS), somites and muscles is demonstred by WISH approach during development up to 24-48 hpf. The cyyr1 knock-down with two different MOs targetting the ATG and the first splice-site of the transcript, affected both CNS and muscle development with a significant rescue in embryo co-injected with cyyr1 mRNA. Defects were also evident in ciliated cells of neuromast of the lateral line. Morphologically the cyyr1-MOs injected embryos display features of embryos inhibited for the Hh pathway through injection of the lefty mRNA, moreover cyyr1 expression was significantly inhibited following Hh inhibition. Interestingly, the injection of cyyr1 mRNA was able to partially rescue Hh-defective phenotype in embryos at 24 hpf. Results from immunofluorescent staining, qPCR and western blotting, support a role for cyyr1 in primary myogenesis probably downstream of Hh pathway. The analysis of CYYR1 expression in rhabdomyosarcoma cell lines seems to indicate an inverse correlation between CYYR1 expression and the range of differentiating capabilities of these cells. These data have encouraged us to better investigate the possible interplay between cyyr1 and Hh-mediated myogenesis even in cyyr1 editing conditions and, as well in rhabdomyosarcoma cell model.
Date
- 2020-03-27
Type
- Doctoral Thesis
- PeerReviewed
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:unibo-26259
Pizzetti, Fabrizio (2020) Ruolo del gene umano CYYR1: dallo studio funzionale dell'ortologo in Danio rerio alla potenziale implicazione in processi tumorigenici, [Dissertation thesis], Alma Mater Studiorum Università di Bologna. Dottorato di ricerca in Scienze farmacologiche e tossicologiche, dello sviluppo e del movimento umano