- Fabrication of microfluidic devices for studying living cells responding to external stimuli by FTIR vibrational spectroscopy
- Mitri, Elisa
Subject
- microfluidic
- FTIR
- Living cells
- microfluidica
- cellule vive
- SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NANOTECNOLOGIE
- FIS/03 FISICA DELLA MATERIA
Description
- 2012/2013
- The present PhD Thesis is about the development of new fabricative strategies to obtain microfluidic devices suitable for InfraRed MicroSpectroscopy (IRMS) studies on living cells in physiological environment and the demonstration of the screening and diagnostic capabilities of this technique for bio-medical applications. IRMS detects the vibrational pattern of molecules allowing the label-free characterization of the chemical profile of a biological specimen and its correlation with the sample morphology. Although powerful and versatile, this technique has been limited until recent years to the study of fixed or dried samples, in order to bypass the problem of water absorptions in the infrared spectral region. The use of microfabrication techniques for the production of Visible-Infrared (Vis-IR) transparent devices has recently opened an innovative approach, able to release some of the constrains encountered when dealing with living cells. Moreover, microfabrication is the best option to achieve long-range reproducibility of the optical path, which is mandatory for an accurate water subtraction in order to disclose cellular IR features. At first, we aimed to develop an IR-Vis transparent microfluidic chip with long-time stability in experimental conditions. The optical transparency was granted by the use of CaF2 or BaF2 as substrates, but their low surface energies imposed a challenge in order to establish reliable microfabrication protocols. With the introduction of a new strategy, that we refer to as “silicon-like”, based on the sputtering of a thin silicon layer onto the IR materials, it was possible to modify the surface properties of the substrates without changing their optical properties. These new substrates allowed the use of several common photo-resists as structural materials. The epoxy-based negative tone SU-8 was chosen for its chemical properties (resistance to solvents and watery media) and its long-term stability in experimental conditions. We established a new sealing protocol exploiting the optical properties of SU-8, able to create a chemical bonding between two already patterned layers of the polymer. It was thus possible to produce a new generation of fluidic chips, characterized by broadband transparency from mid-IR to UV and long-term stability in continuous flow conditions. Subsequently, the devices were employed to perform IRMS measurements on both adherent and circulating cells. In particular, we characterize the spectroscopic features associated to each stage of B16 cell cycle, the changes undergone in living MCF-7 upon exposure to hypo-osmotic and thermal stress and the apoptosis progression of U-937 cells, induced by growth factors removal and CCCP (Carbonyl Cyanide m-Chloro Phenylhydrazone) stimulation. All the studies had the intent to further verify the effectiveness of the microfluidic approach for both circulating and adherent living cells analysis and to prove the capabilities of IRMS as tool for the observation of biochemical processes undergone by live beings. For this reason, to validate the achieved results, a parallel analysis with a well established analytical technique such as the flow-cytometry was performed. The present Thesis demonstrates the capabilities of IRMS coupled with microfluidic technologies, as a diagnostic tool for bio-medical investigation of bio-medical applications. Thanks to the precise control of the cellular microenvironment, as well as its flexibility in terms of experimental design, IRMS could be seen as a new promising frontier for modern biology.
- La presente tesi di dottorato concerne lo sviluppo di nuove strategie fabricative, volte all’ottenimento di dispositivi microfluidici per lo studio di cellule vive, in condizioni fisiologiche, tramite MicroSpettroscopia InfraRossa (MSIR). Inoltre intende dimostrare le potenzialità di questa tecnica analitica come mezzo di screening diagnostico in ambito bio-medico. La MSIR prevede la caratterizzazione di bio-molecole tramite l’acquisizione del loro spettro vibrazionale. A tale spettro viene poi associata un’immagine ottica, ottenendo quindi la correlazione tra il profilo morfologico di un campione e il suo contenuto chimico. Inoltre, l’uso della spettroscopia infrarossa permette una diretta analisi del campione senza l’uso di marcatori esterni o protocolli di fissazione. L’utilizzo di questa tecnica, sebbene molto potente e versatile, fino a pochi anni fa è stato limitato a campioni fissati o deidratati al fine di aggirare i problemi derivanti dal forte assorbimento delle molecole d’acqua nell’infrarosso, noti come “barriera di assorbimento dell’acqua”. L’utilizzo di tecniche di micro fabbricazione per la realizzazione di dispositivi trasparenti nelle regioni del visibile e dell’infrarosso ha permesso di sviluppare un nuovo e innovativo approccio allo studio di campioni biologici tramite MSIR, superando le limitazioni connesse alla “barriera di assorbimento dell’acqua” e quindi alla manipolazione di sistemi viventi. Inoltre, l’approccio micro fabbricativo è la migliore strategia per ottenere una perfetta riproducibilità del cammino ottico, necessaria per sottrarre dallo spettro vibrazionale il contributo dell’acqua e ricavare quindi le caratteristiche spettrali delle cellule. Nella parte iniziale di questo lavoro di tesi, si è rivolta particolare attenzione allo sviluppo di nuovi dispositivi microfluidici trasparenti nel visibile e nell’infrarosso caratterizzati da una lunga stabilità nelle condizioni di misura. I substrati comunemente usati nella MSIR (fluoruro di calcio o bario, CaF2 e BaF2 rispettivamente) hanno una bassa energia superficiale che richiede lo sviluppo di nuovi protocolli fabbricativi per l’ottenimento dei dispositivi. Durante questo lavoro è stata proposta una nuova strategia operativa, chiamata “silicon-like”, che prevede la modifica delle proprietà superficiali dei materiali tramite la deposizione di un sottile strato di silicio sulle finestre ottiche. Lo strato di silicio provoca un incremento dell’energia superficiale del substrato senza alterarne le proprietà ottiche e permette l’uso dei comuni resist come materiali strutturali. Tra questi, si è deciso di utilizzare l’SU-8 una resina epossidica con tono negativo le cui proprietà chimico-fisiche (resistenza ai solventi e all’ambiente acquoso) e la sua stabilità nel tempo soddisfano i requisiti imposti dalle condizioni di misura. Infine è stato sviluppato un nuovo protocollo di chiusura per i dispositivi, sfruttando le proprietà ottiche dell’SU-8. Grazie a queste innovazioni è stato possibile sviluppare una nuova generazione di dispositivi microfluidici dotati di grande stabilità nel tempo e ottima trasparenza nelle regioni del visibile e infrarosso. Successivamente i dispositivi sono stati impiegati per condurre diversi studi sia su cellule circolanti che in adesione tramite MSIR. Nello specifico, sono state caratterizzate le caratteristiche spettrali che distinguono ciascuna fase del ciclo cellulare per le cellule B16, i cambiamenti nel contenuto chimico di cellule MCF-7 indotte da stress di tipo termico e osmotico e i riarrangiamenti cellulari subiti dai monociti (U937) durante la progressione attraverso l’apoptosi. Tutti questi studi avevano l’intento di dimostrare l’utilità dell’approccio microfluidico allo studio di cellule vive tramite MSIR e validare le potenzialità della MSIR come tecnica di indagine diagnostica per i processi biochimici in vivo. Per questo, parallelamente agli esperimenti MSIR sono stati condotti degli esperimenti di citofluorimetria, una tecnica di routine in ambito biologico. Questa tesi dimostra le potenzialità della MSIR accoppiata alla microfluidica come mezzo di indagine bio-medica. Grazie al preciso controllo dell’ambiente cellulare e alla flessibilità ottenibile in termini di design degli esperimenti MSIR può essere vista come una nuova frontiera per la biologia moderna.
- XXVI Ciclo
- 1986
Date
- 2014-06-16T11:08:17Z
- 2014-06-16T11:08:17Z
- 2014-03-25
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-12255