- IN VITRO AND IN VIVO EVALUATION OF SILVER NANOPARTICLES PENETRATION THROUGH HUMAN SKIN
- Bianco, Carlotta
Subject
- silver
- skin
- percutaneous absorption
- nanoparticles
- SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE E TECNOLOGIE CHIMICHE E FARMACEUTICHE
- CHIM/01 CHIMICA ANALITICA
Description
- 2013/2014
- La cute è uno degli organi più estesi del corpo umano e gioca un importante ruolo nella regolazione dell’idratazione corporea, ha proprietà sensoriali, funzioni strutturali e agisce come prima barriera contro gli agenti esterni (Blank et al, 1984). Può costituire un’importante via di uptake per molte sostanze. L’assorbimento percutaneo è stato oggetto di studio in numerosi lavori fin dallo scorso secolo, ma ha recentemente riscosso nuovo interesse a causa dell’ascesa del “mondo delle nanoparticelle”. L’esposizione umana alle nanoparticelle può avvenire sia per cause antropiche che naturali. Dal momento che le nanoparticelle hanno dimensioni compatibili con quelle della via cutanea è importante valutare la possibilità di uptake in scenari di esposizioni reali. Le nanoparticelle di argento (AgNPs) sono sempre più spesso applicate a un’ ampia gamma di materiali a scopo biomedico, proprio perchè sono in grado di rilasciare una considerevole quantità di ioni argento che sono responsabili di un’attività antibatterica ad ampio spettro. Questi materiali nanoparticellati sono solitamente applicati a diretto contatto con la cute umana, nella maggior parte dei casi a cute lesa con una ridotta capacità di agire da barriera. Soprattuto nel caso della cute lesa, questo tipo di esposizione potrebbe portare a un incremento dell’uptake sistemico di argento con potenziali effetti collaterali. I principali obiettivi di questa tesi sono dunque: (i) valutare la permeazione dell’argento da parte di differenti materiali al nanoargento, simulando scenari di esposizione che siano il più possible realistici; (ii) definire i fattori sperimentali che potrebbero influenzare i risultati degli esperimenti in vitro, come ad esempio la metodologia di conservazione della cute; (iii) l’ottimizzazione dei metodi analitici per la quantificazione dell’argento in diverse matrici biologiche. E’ noto dalla letteratura che l’argento sia in grado di permeare la cute, sia intatta che lesa; d’altra parte, non sono disponibili dati riguardo alla permeazione dell’argento attraverso le più comuni tipologie di cute utilizzate come impianti per la cura di ustioni gravi. Petanto in questa tesi la permeazione dell’argento è stata valutata, attraverso il metodo delle Celle a Diffusione di Franz, esponendo campioni di cute fresca, cute crioconservata e cute glicerolata a una sospensione di AgNPs in sudore sintetico per 24 ore. Studiando i profili della permeazione dell’argento nel tempo, risulta evidente una maggiore permeazione attraverso cute glicerolata: il flusso di permeazione dell’argento a 24-h è di 0.2 ng cm-2 h-1 (lag time: 8.2 h) per la cute fresca, 0.3 ng cm cm-2 h-1 (lag time: 10.9 h) per la crioconservata, e 3.8 ng cm-2 h-1 (lag time: 6.3 h) per la glicerolata. La permeazione attraverso cute glicerolata è significativamente più alta sia rispetto alla cute fresca che a quella crioconservata. Questo risultato potrebbe avere delle importanti implicazioni cliniche per il trattamento delle ustioni con prodotti al nanoargento. Un ulteriore importante risultato è che la permeazione attraverso cute crioconservata non differisce significativamente da quella fresca. Ciò giustifica l’utilizzo di cute crioconservata nel caso di esperimenti in vitro. Una volta valutata la permeazione cutanea attraverso i diversi modelli di cute e determinato quindi il modello più idoneo per gli studi in vitro, il secondo obiettivo di questa tesi è quello di caratterizzare il rilascio di argento da parte di alcuni tessuti al nanoargento, disponibili in commercio, e determinare l’assorbimento percutaneo in vitro dell’argento da essi rilasciato. E’ stato effettuato uno screening preliminare di otto diversi tessuti all’argento in modo da scegliere, per successivi studi, materiali che fossero in grado di rilasciare un quantitativo elevato di argento e il cui utilizzo avesse una certa rilevanza sul piano sociale. I tessuti selezionati sono stati due diverse garze per la cura di cute lesa (ustioni o tagli) e un pigiama ideato per bambini affetti da Dermatite Atopica. L’assorbimento percutaneo in vitro è stato determinato immergendo 3 pezzi di ciascun materiale nel sudore sintetico contenuto nelle celle donatrici di Franz. La caratterizzazione dell’argento presente nei tessuti è stata effettuata mediante Scanning Electron Microscopy with integrated Energy Dispersive X-Ray spectroscopy (SEM-EDX) e Atomic Force Microscopy (AFM). La concentrazione dell’argento nelle soluzioni donatrici e nella cuteè stata determinate mediante un Electro Thermal Atomic Absorption Spectrometer (ET-AAS) e un Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (ICP-MS). Tutti i tessuti analizzati contenevano AgNPs di diverse dimensioni e morfologia e, in seguito all’immersione in sudore, è stata rilevata la presenza di clusters di AgCl sulla superficie delle fibre. Le concentrazioni di argento in sudore sintetico raggiungevano tra i 21 e i 104 µg/g (w/w). Sono stati inoltre rilevati microaggregati di Ag e di AgCl sia nell’epidermide che nel derma utilizzati per l’esperimento. Le dimensioni di questi aggregati suggerisce che la loro formazione avvenga a causa di fenomeni di precipitazione proprio tra gli strati cutanei. Inoltre, il fatto che l’argento sia stato trovato anche negli strati più interni della cute vascolarizzata (derma) suggerisce la possibilità di assorbimento sistemico dell’argento permeato. Alla luce di questi risultati sarebbe quindi opportuno valutare anche l’esposizione ripetuta e prolungata nel tempo. Poiché non sono state rilevate significative differenze tra i tre materiali testati, il pigiama al nanoargento è stato selezionato per la successiva stperimentazione in vivo. I dati riguardanti l’uptake in vivo dell’argento in seguito a esposizione cutanea sono limitati, in parte a causa della mancanza di metodi analitici adeguati per la determinazione dell’argento in matrice biologica. Un ulteriore obiettivo di questa tesi è dunque lo sviluppo di un metodo analitico per la quantificazione dell’uptake in vivo su soggetti che abbiano indossato il tessuto al nanoargento. Campioni dello strato più esterno dell’epidermide (Stratum Corneum, SC) sono stati prelevati, mediante tapes adesivi, da volontari che avevano indossato il tessuto al nanoargento secondo scenari realistici. Diverse tipologie di estrazione dell’argento dai tapes adesivi sono state confrontate; le soluzioni estraenti sono state analizzate per la quantificazione dell’argento mediante ICP-MS. Il metodo descritto in questa tesi ha come limite di detezione (LOD) 2 ng di Ag per campione di SC. Il metodo permette di misurare la concentrazione di Ag a diversi spessori di SC permettendo di ricavare le cinetiche di permeazione dell’argento. La sensibilità del metodo permette inoltre di determinare la concentrazione dell’argento in ultra trace nelle urine dei soggetti prima e dopo l’esposizione cutanea (LOD=0.010 µg Ag / L in urina). Il metodo sopra descritto è stato quindi applicator per determinare l’assorbimento percutaneo in vivo in seguito a ripetuta esposizione di soggetti sani e di pazienti affetti da dermatite atopica. Inoltre, è stato valutato l’effetto infiammatorio dell’argento permeate nella cute. Soggetti sani (n=15) e pazienti affetti da una lieve forma di dermatite atopica (n=15) hanno indossato una manica di tessuto contenente il 3.6% di argento, su di un avambraccio, e, sull’altro, un tessuto placebo (senza argento) per le 8 ore notturne, per 5 giorni consecutivi. La permeazione dell’argento è stata valutata analizzando l’andamento della concentrazione in funzione della profondità di SC prelevato dall’avambraccio, dopo la prima e la quinta esposizione. Inoltre, I campioni di SC sono stati analizzati mediante SEM-EDX e AFM per valutare la presenza di aggregati o nanoparticelle di argento eventualmente penetrate. L’uptake sistemico è stato verificato determinando la conentrazione di Ag nelle urine raccolte prima e dopo i cinque giorni di esposizione. Il quadro infiammatorio è stato valutato comparando i livelli di interleuchine IL-1α e IL-1RA nella cute tra siti esposti e non esposti dopo i 5 giorni di esposizione. L’argento è stato quantificato con i metodi descritti in precedenza. Il flusso di argento attraverso lo SC al raggiungimento dello stato stazionario in soggetti sani e nei pazienti era rispettivamente di 2.3 (1.2-3.8) e 2.0 (0.8-4.1) *10-6 mg Ag/cm2/h. Sui tape strips campionati dagli avambracci esposti all’argento, sono stati trovati aggregati di argento in un ampio range dimensionale. Il SEM-EDX ha rilevato la presenza di aggregati nel range 150-2000 nm in tutti i campioni prelevati, con un numero descrescente partendo dagli strati cutanei più esterni a quelli più interni. L’AFM ha confermato la presenza di questi aggregati e ha inoltre evidenziato le differenze strutturali tra i soggetti sani e quelli affetti da dermatite atopica. Non è stato riscontrato argento nei campioni derivanti dalla cute esposta al placebo. L’EDX ha rivelato che alcuni aggregate di argento contenevano inoltre zolfo e cloro. I livelli urinari di argento non hanno subito variazioni significative in seguito all’esposizione né nei casi né nei controlli. Infine non sono state riscontrate differenze nei livelli di interleuchine in seguito all’esposizione al tessuto contenente nanoargento. La presenza di aggregati con dimensioni sub-micrometriche è probabilmente dovuta a una precipitazione in vivo di ioni argento permeati attraverso lo SC e all’ aggregazione delle nanoparticelle permeate. La presenza di zolfo negli aggregati è probabilmente dovuta alla chelazione dell’argento da parte dei tioli delle proteine nello SC. L’AFM ha inoltre mostrato la presenza di un sottile strato lipidico sulla superficie degli aggregati suggerendo una penetrazione attraverso gli spazi intercellulari. L’interazione dell’Ag con le proteine dello SC e la formazione di aggregati potrebbe facilitare la creazione di una riserva di ioni Ag+ negli starti cutanei. Gli aggregati potrebbero lentamente rilasciare Ag, rendendo l’esposizione effettiva più lunga. D’altra parte, la misura degli aggregati è troppo grande perchè possano ulteriormente diffondere e potrebbero venire rimossi dai normali processi di desquamazione; perciò la formazione degli aggregati potrebbe anche essere svantaggiosa per un ulteriore assorbimento di Ag. I dati riguardanti l’assorbimento percutaneo in vivo e l’escrezione urinaria di Ag mostrano che il quantitativo di argento assorbito per via cutanea (secondo questo scenario di esposizione) è inferiore alla dose di riferimento corrente proposta dall’ US Environmental Protection Agency (EPA). Inoltre, l’esposizione cutanea al tessuto contenente nanoargento non ah alterato il quadro infiammatorio delle citokine nella cute. In questa tesi è stata testata un’ esposizione che non supera i 5 giorni consecutivi. I dati ottenuti secondo questo scenario espositivo hanno rivelato che l’assorbimento cutaneo dopo aver indossato il tessuto in esame è basso e non dovrebbe realisticamente portare a tossicità a livello sistemico. D’altra parte questi risultati evidenziano la necessità di valutare sia gli effetti sistemici in seguito a un’esposizione più prolongata nel tempo, soprattutto in soggetti con cute danneggiata, sia il destino nel tempo delle forme di argento trattenute nella cute.
- XXVII Ciclo
- 1985
Date
- 2015-06-08T14:36:56Z
- 2015-06-08T14:36:56Z
- 2015-04-15
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-14036