- Telomere regulation by microRNAs in human breast cancer
- Dinami, Roberto
Subject
- telomere
- telomerase
- miRNA
- TRF1
- TERT
- SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
- BIO/11 BIOLOGIA MOLECOLARE
Description
- 2013/2014
- Nei vertebrati i telomeri sono strutture specializzate localizzate all’estremità dei cromosomi costituito da sequenze ripetute TTAGGG. L’ accorciamento progressivo del telomero ad ogni divisione cellulare porta ad una disfunzione telomerica e all’attivazione della risposta di danno al DNA alle estremità cromosomiche. L’attivazione del segnale di danno al DNA provoca senescenza o apoptosi, fenomeni legati all’invecchiamento. Per mantenere la funzione del telomero il complesso della telomerasi, costituito dalla componente ad RNA (hTERC) e dalla subunità catalitica (hTERT), aggiunge ripetizioni telomeriche in cellule con alto potenziale replicativo. Due complessi principali sono coinvolti nella regolazione dei telomeri: il complesso shelterin e il complesso della telomerasi. Shelterin è costituito da sei principali proteine: TRF1, TRF2, POT1, TPP1, TIN2 e RAP1, e controlla vari aspetti della funzione telomerica come la lunghezza telomerica, la ricombinazione e la protezione da fattori di risposta al danno al DNA. l’evasione dalla senescenza replicativa raggiunta con la riattivazione della telomerasi, è un passaggio chiave nel processo di tumorigenesi, come osservato nel 90% dei tumori umani. Inoltre, aumentano anche le dimostrazioni che indicano il ruolo centrale di shelterin nella formazione e nella progressione del cancro. L’espressione del complesso shelterin o della telomerasi è strettamente regolata a livello trascrizionale e post-traduzionale, anche se il ruolo dei miRNAs nella regolazione dei telomeri non è ancora stato studiato. Lo scopo del mio progetto di tesi era quello di identificare miRNAs che controllano l’espressione dei componenti di shelterin o del complesso della telomerasi e valutare la rilevanza clinica di questi miRNAs nel contesto del tumore al seno. Per raggiungere questo obiettivo abbiamo eseguito un high-throughput luciferase reporter screening in cellule HeLa identificando un panello di miRNAs che hanno come bersaglio il 3’UTR di componenti del complesso shelterin (TRF1, TRF2, POT1) o del complesso della telomerasi (TERT, DKC1). Con questo screening abbiamo identificato che l’onco-miRNA miR-155 è un efficiente regolatore di TRF1. Il miR-155 è up-regolato in tutti i tipi di tumore al seno ed alti livelli del miR-155 correlano con una bassa espressione dei livelli proteici di TRF1. Inoltre, abbiamo validato con ulteriori saggi luciferasi il targeting di TRF1 da parte del miR-155 ed abbiamo anche scoperto che il miR-155 controlla l’espressione di TRF1 a livello traduzionale. Soprattutto, la bassa espressione dei livelli di mRNA di TRF1 e la bassa espressione dei geni bersaglio del miR-155 correlano con una ridotta sopravvivenza libera da metastasi distanti (DMFS) e con una ridotta sopravvivenza libera da recidive (RFS) in pazienti con cancro al seno luminale estrogeno-positivo (ER+). Questo indica che il targeting di TRF1 da parte del miR-155 è parte di una signature del miR-155 che determina una scarsa sopravvivenza nel cancro al seno di tipo luminale ER+. Soprattutto abbiamo scoperto che il targeting di TRF1 da parte del miR-155 porta ad un aumento della fragilità telomerica, a fusioni telomeriche dei cromatidi fratelli e all’allungamento dei telomeri. Il nostro lavoro dimostra per la prima volta che la regolazione post-trascrizionale di TRF1, mediata dal miR-155, è un efficiente meccanismo per controllare la fragilità telomerica e l’instabilità genomica nel cancro al seno. Invece, per quanto riguarda i miRNAs che regolano la telomerasi nel cancro al seno, abbiamo studiato il miR-296-5p e il miR-512-5p, i quali bersagliano efficientemente hTERT come mostrato dal high-throughput luciferase reporter screening . Entrambi i miRNAs bersagliano specifiche regioni nel 3’UTR di hTERT portando alla degradazione dell’mRNA di hTERT e alla riduzione dell’attività telomerasica. Dati clinici rivelano che il miR-296-5p e il miR-512-5p sono down-regolati nei tessuti tumorali del seno. Inoltre, abbiamo scoperto che l’aumento dell’espressione di hTERT e l’aumentata espressione dei geni bersaglio del miR-296-5p e del miR-512-5p correlano con una scarsa sopravvivenza in pazienti con cancro al seno di tipo basale. Questo evidenzia l’importanza clinica del miR-296-5p e del miR-512-5p nel cancro al seno (basale). A livello molecolare abbiamo mostrato che il miR-296-5p e il miR-512-5p rallentano la proliferazione cellulare e provocano l’ accorciamento della lunghezza dei telomeri in cellule di tumore al seno basale. Soprattutto, abbiamo scoperto che la ri-espressione epigenetica dei geni del miR-296-5p e del miR-512-5p in cellule di tumore al seno basale, determina l’aumento dell’espressione del miR-296-5p e del miR-512-5p e la conseguente riduzione dell’espressione di hTERT. I nostri dati suggeriscono che l’utilizzo di composti che inducono la ri-espressione del miR-296-5p e del miR-512-5p potrebbe essere una strategia promettente per compromettere i meccanismi di mantenimento dei telomeri e la funzione di hTERT nel cancro al seno. I risultati di questo lavoro dimostrano che i miRNAs rappresentano dei nuovi regolatori della funzione telomerica e hanno un impatto sull’omeostasi dei telomeri nel cancro umano. Questo lavoro identifica i miRNAs come nuovi bersagli per modulare la funzione dei telomeri nelle malattie ad essi correlate come il cancro e l’invecchiamento.
- Vertebrate telomeres are specialized structures localized at the end of chromosomes that are composed of TTAGGG tandem repeats. Progressive telomere shortening with every cell division, finally leads to telomere dysfunction and the induction of a DNA damage response at chromosome ends. DNA damage signaling provokes senescence or apoptosis, phenomena linked to organismal aging. In order to maintain telomere function the telomerase reverse transcriptase complex, composed by the RNA component (hTERC) and the catalytic subunit (hTERT) replenishes telomere repeats in cells with high replicative potential. Two main complexes are involved in the regulation of telomeres: shelterin and the telomerase complex. Shelterin is composed of six main proteins: TRF1, TRF2, POT1, TPP1, TIN2, and RAP1 and controls various aspects of telomere function such as telomere length, recombination and protection from the DNA damage response factors. The escape from replicative senescence is a key step in tumorigenesis and it is achieved by the reactivation of telomerase activity, as observed in 90% of human cancers. However, increasing body of evidence also indicates a central role of shelterin in cancer formation or progression. The expression of telomerase and shelterin complex is tightly regulated at transcriptional and post-translational level, however the role of miRNAs in telomere regulation is not understood. The aim of my PhD thesis project was to identify miRNAs that control the expression of components of the shelterin or telomerase complex and to evaluate the clinical relevance of these miRNAs in the context of human breast cancer. To achieve this goal we performed a high-throughput luciferase reporter screening in HeLa cells and identified a panel of miRNAs that target the 3’UTR of shelterin (TRF1, TRF2, POT1) or telomerase complex components (TERT, DKC1). In this screening we identified the onco-miRNA miR-155 as efficient regulator of TRF1 expression. miR-155 is efficiently upregulated in across all types of human breast cancer and high miR-155 levels correlate with low TRF1 expression levels. We validated targeting of TRF1 by miR-155 in additional luciferase reporter assays and found that miR-155 controls TRF1 expression on the translational level. Importantly, low TRF1 mRNA expression but also low expression of miR-155 target genes is linked to reduced distant metastasis-free survival and relapse-free survival of estrogen receptor positive luminal breast cancer patients. This indicates that targeting of TRF1 by miR-155 is part of a miR-155 signature that mediates poor survival in ER+ luminal breast cancer. Importantly, we found that targeting of TRF1 expression by miR-155 leads to increased telomere fragility, telomere sister chromatid fusions and telomere elongation. Our work demonstrates, for the first time, that post-transcriptional regulation of TRF1 by miR-155 is an efficient mechanism to control telomere fragility and genomic stability in the context of human breast cancer. Concentrating on miRNA dependent mechanisms of telomerase regulation in human breast cancer we studied miR-296-5p and miR-512-5p that were found to efficiently target hTERT in the high throughput luciferase reporter assay. Both miRNAs target specific motifs in the hTERT 3’UTR, leading to degradation of the hTERT mRNA and reduction of telomerase activity. Clinical data reveal that miR-296-5p and miR-512-5p are downregulated in breast cancer tissues. Importantly, we found that increased hTERT expression but also high expression of miR-296-5p or miR-512-5p target genes is linked to poor survival in basal breast cancer patients. This highlights the clinical relevance of miR-512-5p and miR-296-5p in basal breast cancer. On the molecular levels we showed that miR-296-5p and miR-512-5p impair cell proliferation and provoke progressive telomere shortening in basal breast cancer cell lines. We further found that epigentic de-repression of the miR-296 and miR-512 genes in a basal breast cancer cell line increase the expression of miR-296-5p and miR-512-5p levels to reduce hTERT expression. Our data suggest that the use of drugs that release miR-296-5p or miR-512-5p expression might be a promising strategy to impair telomere maintenance mechanisms and hTERT function in human breast cancer. Altogether, my work demonstrated that miRNAs represent new regulators of telomere function that impact on telomere homeostasis in human cancer. This identifies miRNAs as novel targets to modulate telomere function in telomere related maladies such as cancer and aging.
- XXVII Ciclo
- 1986
Date
- 2015-06-08T14:47:27Z
- 2016-04-28T04:01:11Z
- 2015-04-28
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
- application/pdf
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Identifier
urn:nbn:it:units-14048