- Conformational properties of variable density DNA nanobrushes
- Conformational properties of variable density DNA nanobrushes
- Nkoua Ngavouka, Maryse Dadina
Subject
- AFM
- DNA
- ss(ds-)-DNA
- SAMs
- Nanografting
- MD
- polymers brushes
- Salts
- SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NANOTECNOLOGIE
- FIS/03 FISICA DELLA MATERIA
Description
- 2013/2014
- Advanced nanotechnologies allow the manipulation of molecules with nanoscale precision, and can be used for the production of sensitive devices for protein or nucleic acids detection for clinical use. DNA nano-assemblies are an excellent route for ultrasensitive DNA/RNA detection and for DNA-protein conjugated immobilization, for bio interaction studies, through the careful detection of single strand DNA (ssDNA) hybridization with complementary target sequences. For DNA nanoscale devices, the control of DNA surface density and conformation is crucial in order to achieve the highest reproducibility and to optimize the sensitivity. An improved understanding of the chemical and physical properties of the nanoscale DNA assemblies and of the recognition process is necessary for device performance optimization. In this framework, we first focused on the understanding of the mechanisms that optimize and limit hybridization efficiency in variable density DNA monolayers. We performed Atomic Force Microscopy (AFM) assisted-Nanografting and AFM measurements to realize reference patches into a DNA self-assembled monolayer, and to carefully monitoring DNA hybridization. We then performed molecular dynamics (MD) simulations, in collaboration with a theoretical group, to capture the energetic hybridization limit in high dense DNA monolayers. We found that no more than 44% of the substrate ssDNA can be successfully hybridized, limited by molecular and electrostatic crowding effect connected to the highly charged nature of DNA. To further capture the conformational properties of DNA monolayers, and their relation to biorecognition, we characterized the ionic strength effect on ssDNA nano-assembled of different density by careful AFM topography measurements in liquid environment. We confined ssDNA brushes with controlled surface densities within a bio-repellent self-assembled monolayer. We then monitored the topographic brush height variation upon changing salt type (NaCl, KCl, CaCl2 and MgCl2 ) and concentration inside the liquid cell. We showed that the measured height is related to scaling law of salt concentration, in agreement with the theory of polyelectrolyte brush. Using this scaling model to fit our experimental data, we quantified structural parameters such as the average internucleotide distance (d) for ssDNA brushes of different, estimated surface density σ, featuring a strong dependence of d on different salts species. This result is crucial for the structural designing of synthetic nucleic acids and, more generally, nucleic acid-based devices with controlled physical behaviors. In the last part of the work, we apply all knowledge learned on hybridization mechanism to a clinical problem. We studied the hybridization mechanism to distinguish single base mismatch and to detect at high sensitivity, without any labeling and amplification, microRNAs (miRNAs) connected to hearth failure disease. Our results demonstrate that the AFM nanolithography can serve as a sensitive and selective readout system to discriminate single nucleotide polymorphism. Also, our device allows for the detection of more than one sequence of miRNAs on a same assay with target in picomolar (100pM) range concentration.
- I recenti sviluppi delle nanotecnologie permettono di manipolare singole molecole con precisione nanometrica, e possono essere utilizzati per la produzione di dispositivi innovativi ad alta sensitivita` per la rivelazione di proteine e acidi nucleici, per usi clinici. Nanostrutture di DNA a singolo filamento rappresentano una eccellente soluzione per la rivelazione ultrasensibile di frammenti di DNA/RNA e per l’immobilizzazione di coniugati DNA-proteina per studi di bioriconoscimento, attaverso lo studio dell’ibridazione del DNA con le sequenze target complementari. Nello sviluppo di dipositivi alle nanoscale basati sul DNA, il controllo di parametri quali la densita` di superficie e la conformazione del DNA, risulta cruciale per raggiungere gli alti livelli di riproducibilita` richiesti e per ottimizzare la sensitivita`. Studiare e capire in dettaglio le proprieta` chimico -fisiche di strutture alle nanoscale di DNA a singolo filamento, e del relativo processo di bioriconoscimento risulta quindi fondamentale per ottimizzare le prestazioni del dispositivo associato. In questo contesto, ci siamo dapprima focalizzati sullo studio dei meccanismi che ottimizzano e limitano l’efficienza di ibridazione in monolayer di DNA. Usando il microscopio a forza atomica (AFM) e una tecnica di nanolitografia basata sull’AFM, il nanografting, abbiamo costruito delle nanostrutture di riferimento in film di DNA autoassemblati, ad alta densita`, ed abbiamo accuratamente monitorato con l’AFM e con simulazioni di dinamica molecolare, il limite di ibridazione in tali film. In collaborazione con un gruppo di fisici teorici, abbiamo trovato un limite di ibridazione pari a circa il 44% delle sequenze probe, collegandolo a effetti di repulsione elettrostatica dovuta all’ alta densita` a di carica nei monolayer di DNA, un polielettrolita altamente carico in soluzione. In un secondo tempo, per cogliere le proprieta` conformazionali dei monolayer di DNA, e la loro relazione con la capacita` di bioriconoscimento, abbiamo creato delle nanostrutture di DNA a singolo filamento, a densit variabile, in un monostrato autoassemblato di molecole bio-repellenti, e caratterizzato l’effetto della forza ionica della soluzione a mezzo di misure topografiche fatte con l’ AFM, in liquido. Da misure di variazione dell’ altezza topografica delle nanostrutture di DNA in funzione dei diversi sali usati in soluzione (NaCl, KCl, CaCl2 and MgCl2 ) e della loro concentrazione, abbiamo dimostrato che, per ogni sale, l’ altezza` legata alla concentrazione da una legge di scala, in accordo con la teoria dei polyelectrolyte brush. Utilizzando questa legge di scala, abbiamo fatto un fit dei dati sperimentali, quantificando un importante parametro strutturale, la distanza media tra nucleotidi nel filamento (d), per nanostrutture di DNA con divesra densita`, anch’essa stimata dal nostro fit. Questo risultato e` fondamentale per il disegno di acidi nucleici sintetici e piu` in generale per la progettazione di dispositivi miniaturizzati per la rivelazione di acidi nucleici. Nella parte finale di questo lavoro di tesi, abbiamo applicato le conoscenze acquisite sui meccanismi di ibridazione del DNA su scale nanometriche, per realizzare dispositivi utili a scopi clinici. Abbiamo studiato il meccanismo di ibridazione per distinguere un mismatch tra due filamenti complementari di DNA relativo a una singola base e alla rivelazione di micro-RNA, biomarcatori rilevanti per monitorare specifiche malattie quali, nel presente caso, malattie cardiovascolari. Abbiamo dimostrato che i nostri nanodispositivi dimostrano un’ottima risoluzione (100 pM o meglio) e che possono essere utilizzati senza bisogno di amplificazione del materiale genetico originale, o di altre modificazioni, in estratti provenienti da plasmi umani. Queste piattaforme possono essere ulteriormente sviluppate per il monitoraggio di polimorfismi di singolo nucleotide, estremamente rilevanti dal punto di vista clinico
- XXVII Ciclo
- 1986
Date
- 2015-06-09T07:53:05Z
- 2015-06-09T07:53:05Z
- 2015-03-23
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-14056