- Studio della modulazione ormonale della riproduzione e della crescita nei Crostacei Decapodi mediante l'uso di neurormoni ricombinanti ed anticorpi specifici
- Mosco, Alessandro
Subject
- ammidazione
- saggi biologici
- peptidi ricombinanti
- crostacei
- cHH
- NEUROSCIENZE
- BIO/05 ZOOLOGIA
Description
- 2006/2007
- L’ormone iperglicemico dei crostacei (cHH) appartiene ad una famiglia di neuropeptidi che sono prodotti e rilasciati in circolo nel complesso organo X-ghiandola del seno, localizzato nei peduncoli oculari dei crostacei. Il ruolo principale del cHH è quello di regolare il livello emolinfatico del glucosio, ma questo ormone è implicato anche nel controllo di altre funzioni come la secrezione di enzimi digestivi, la muta, la riproduzione, il metabolismo lipidico, l’osmoregolazione e le risposte da stress. Il cHH maturo possiede sei cisteine che formano tre ponti disolfuro, l’estremità C-terminale ammidata e l’estremità N-terminale bloccata dal piroglutammato come in Carcinus maenas e Jasus lalandii oppure libera come in Penaeus schmitti. L’ammidazione carbossiterminale è una modificazione post-traduttiva rilevante che fornisce attività biologica ad un grande numero di peptidi, sia nei vertebrati che negli invertebrati. Il ruolo essenziale dell’ammidazione nel conferire un’attività iperglicemica al cHH è stato provato sinora solo per il cHH di Marsupenaeus japonicus. Per stabilire la funzione dell’ammidazione sull’attività biologica del cHH in altre specie, un peptide ricombinante di 73 residui, Asl-rcHH-Gly, è stato espresso, foldato, purificato e trattato con l’enzima di ammidazione in modo da ottenere l’ormone ammidato, Asl-rcHH-ammide. Con questo peptide ricombinante sono stati condotti dei saggi biologici su due specie appartenenti alla stessa superfamiglia (Astacoidea) ed infraordine (Astacidea) che erano Astacus leptodactylus, la specie dalla quale è stato clonato il cHH, e Procambarus clarkii, il cui cHH differisce da quello di A. leptodactylus per due soli amminoacidi, e su una specie filogeneticamente più distante come Palaemon elegans, che appartiene ad un diverso infraordine (Caridea). Asl-rcHH-ammide ha mostrato di avere in A. leptodactylus un’attività iperglicemica comparabile a quella del peptide nativo estratto dalle ghiandole del seno. Raddoppiando la quantità di Asl-rcHH-ammide iniettato si è osservata una risposta più forte con una concentrazione emolinfatica di glucosio di quasi il doppio a conferma dell’effetto dose dipendente dell’ormone nell’indurre l’iperglicemia. Il profilo della curva da stimolo era differente nel caso l’iperglicemia fosse stata indotta da 1,7 pmol/g di peso vivo oppure da 3,3 pmol/g di peso vivo di Asl-rcHH-ammide oppure dai peptidi nativi. Il peptide ricombinante induceva un incremento massimo nella risposta dopo un’ora, mentre l’estratto di ghiandole del seno induceva una risposta più lenta, con un spostamento del picco di iperglicemia alle due ore. Dopo l’iniezione di 1,7 pmol/g di peso vivo del peptide ammidato, l’effetto iperglicemico si esauriva entro le due ore dallo stimolo ed a quattro ore l’iperglicemia non era più osservabile. Questo comportamento è in buon accordo con l’emivita di circa 10 min riportata per il cHH. L’iniezione di una dose maggiore di Asl-rcHH-ammide non solo ha indotto un effetto maggiore, ma ha anche ritardato il ritorno al livello basale del glucosio, dovuto ad una insufficiente rimozione del peptide dall’emolinfa a causa dell’alta concentrazione dell’ormone circolante. Una simile tendenza è stata osservata anche per l’estratto di ghiandole del seno che ha mantenuto un forte effetto iperglicemizzante anche a quattro ore dalla stimolazione. Il Asl-rcHH-Gly non ha mostrato una potenza comparabile. Questi risultati dimostrano chiaramente che l’ammidazione è essenziale nel provvedere una completa funzionalità biologica al cHH, dato che il peptide non ammidato che possiede una potenza inferiore. Infatti, per osservare un effetto iperglicemico paragonabile a quello indotto dall’ormone ammidato, il peptide non ammidato deve essere iniettato a dosi elevate. Asl-rcHH-ammide è stato in grado di indurre una risposta iperglicemica anche in P. clarkii sebbene più debole di quella indotta in A. leptodactylus. Il profilo temporale della risposta era simile, con un picco di massima presente ad un’ora. Invece, l’iniezione di Asl-rcHH-Gly ha fornito un’attività iperglicemica molto debole. Per provare la capacità di Asl-rcHH-ammide di indurre l’iperglicemia in una specie filogeneticamente più distante da A. leptodactylus, è stato fatto un saggio eterologo sul gamberetto P. elegans. Anche in questa specie, Asl-rcHH-ammide è stato in grado di indurre una risposta rilevabile con un picco di glucosio presente dopo un’ora che aveva raddoppiato il livello basale, sebbene questo effetto positivo fosse di molto inferiore a quello indotto in A. leptodactylus e P. clarkii. L’attività di Asl-rcHH-Gly nel gamberetto era ancora più bassa se paragonata a quella del peptide ammidato. Questo dimostra che persino in specie filogeneticamente distanti l’attività biologica dell’ormone viene mantenuta parzialmente, probabilmente a causa di una somiglianza strutturale nel neuropeptide. Particolarmente interessante è il fatto che il peptide ammidato abbia indotto risposte diverse a seconda del sesso degli animali. Nei maschi si è ottenuta una forte risposta iperglicemica correlata all’elevata quantità di ormone iniettato, mentre la risposta nelle femmine è stata significativamente di molto inferiore. Questo dato fa supporre che nelle femmine vi fosse una diminuita affinità dei recettori verso il cHH oppure che le cascate dei segnali intracellulari attivati dal legame del cHH con i recettori fossero, in qualche modo, disattivate. Anticorpi specifici anti Asl-rcHH sono stati purificati da antisiero di coniglio mediante cromatografia per affinità, dove il Asl-rcHH era accoppiato alla resina. L’iniezione di questi anticorpi in A. leptodactylus 10 min prima dell’iniezione del Asl-rcHH ammidato ha fornito una risposta iperglicemica depressa, dimostrando che un’adeguata quantità di anticorpi specifici può essere usata per modulare l’asse ormonale nei gamberi. Con questo lavoro si è dimostrata l’importanza dell’ammidazione C-terminale per la funzionalità biologica del cHH; si è prodotto un peptide ricombinante con un’attività biologica paragonabile a quella dell’ormone nativo; si è evidenziato che l’attività del cHH dipende non solo dalla quantità di ormone circolante, ma è anche legata alla responsività degli organi bersaglio; si è dimostrato che è possibile modulare la funzionalità di un ormone mediante l’iniezione di anticorpi specifici. La possibilità di avere a disposizione un cHH pienamente funzionante apre la strada a molteplici studi atti a comprendere meglio il ruolo di questo ormone nei processi fisiologici dei crostacei. Inoltre, è possibile pensare di effettuare dei trattamenti a base di peptidi ricombinanti associati ad alginati, da somministrare sotto forma di mangime, in modo da avere una modulazione esterna degli assi ormonali. La preparazione di un anticorpo specifico anti-cHH consentirà la messa a punto di un dosaggio ELISA da usare per monitorare le variazioni nella concentrazione emolinfatica di questo ormone legate agli stadi di crescita, riproduzione oppure dovute a fattori stressogeni.
- XX Ciclo
- 1955
Date
- 2008-06-12T08:31:30Z
- 2008-06-12T08:31:30Z
- 2008-03-13
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-5786