- Ruolo dei canali del K+ herG nello sviluppo neuronale nella fisiopatologia dell'epilessia.
- Cilia, Emanuele
Subject
- Canali del K+ hERG e ruolo nell'epilessia
- NEUROSCIENZE
- Neuroscienze
Description
- 2006/2007
- Università degli studi di Trieste Riassunto Ruolo dei canali di K+ hERG nello sviluppo neuronale e nella fisiopatologia dell’epilessia Ciclo: XX Coordinatore: Chia.ma Prof.ssa Paola Lorenzon Dottorando: Emanuele Cilia Lo scopo di questa tesi è stato quello di individuare e definire una correlazione fra canali della famiglia ERG e la sindrome epilettica. Le motivazioni che hanno spinto ad affrontare sperimentalmente questo argomento risiedono, da una parte nel crescente coinvolgimento dei canali voltaggio-dipendenti nell’epilessia, dall’altra dal fatto che i canali ERG sono altamente espressi nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) di topo e di ratto e sono in grado di controllare l’eccitabilità neuronale. Studi di espressione relativi ai geni e alle proteine di questa famiglia sono stati condotti, nel nostro laboratorio, sul SNC di topo (Guasti et al., 2005). Una prima parte del lavoro oggetto della presente tesi ha avuto pertanto lo scopo di approfondire tali studi di espressione, applicandoli anche a colture organotipiche di midollo spinale, ottenute da topi sia in età embrionale che neonatale. Tali studi, nei quali è stata verificata l’espressione dei canali ERG sia a livello di m-RNA che di proteina hanno evidenziato che tutti i geni (e le proteine) m-erg sono espressi in tali colture, seguendo un preciso pattern spazio-temporale (Furlan et al., 2005). Tali studi hanno inoltre permesso di ipotizzare un ruolo importante della corrente ERG IK(ERG) durante le prime fasi dello sviluppo, essendo espresso in maniera specifica ed età-dipendente solo da alcune specifiche popolazioni neuronali. In seguito, una volta completato lo studio del pattern di espressione dei geni e delle proteine ERG nel SNC di topo e di ratto, è stata avanzata l’ipotesi che i canali ERG potessero essere coinvolti nel fenomeno epilettico. Pertanto, la seconda parte del lavoro oggetto della presente tesi si è basato sulla analisi della modulazione dei geni erg nell’ippocampo di topo durante l’induzione di epilessia sperimentale ottenuta tramite l’inoculo di acido Kainico e Pilocarpina. Il lavoro sperimentale si è articolato in due fasi: nella prima fase è stato asportato l’ippocampo di topi inoculati con farmaci epilettogeni (acido Kainico e Pilocarpina) e di topi inoculati con soluzione fisiologica (considerati topi di controllo); nella seconda fase gli ippocampi sono stati tagliati (ad una determinata distanza dal punto Bregma) e sono state asportate tre fette, su cui sono stati eseguiti esperimenti di Real Time PCR al fine di quantificare l’espressione dei geni m-erg1, m-erg2 e m-erg3. Nessuno dei tre geni m-erg è stato modulato in modo significativo a seguito delle crisi epilettiche indotte né da acido Kainico, né da Pilocarpina. Questi risultati apparentemente negativi ci hanno viceversa stimolato a valutare l’ipotesi opposta, e cioè se alterazioni primitive della funzionalità dei canali ERG potessero essere in grado di rappresentare il “primum movens” della malattia epilettica. Nella terza parte della presente tesi, è stata pertanto condotta un’analisi genetica in famiglie affette da epilessia idiopatica valutando eventuali mutazioni del gene herg3, (KCNH7), al fine di valutare un ruolo patogenetico di tale canale in questo tipo di sindrome. La nostra attenzione si è rivolta verso lo studio di questo gene, perché risulta l’unico, della famiglia ERG, ad essere espresso specificamente nel SNC senza alcuna espressione a livello cardiaco, come accade per herg1. A tale scopo è stato messo a punto un protocollo sperimentale per l’analisi del DNA genomico mediante la tecnica della DHPLC (Denaturyng High Performance Liquid Chromatography) e successivo sequenziamento. Sono stati identificati 3 profili mutati, nelle sequenze relative agli esoni 4 (dominio N-terminale della proteina), 6 (regione comprendente la prima porzione transmembrana) e 13 (porzione C-terminale). Sono state inoltre identificate le specifiche mutazioni nucleotidiche che provocano un cambiamento nella sequenza amminoacidica. In particolare a livello dell’esone 13 è risultata un cambiamento nucleotidico a→g, che determina, a livello amminoacidico, un cambio Serina (AA basico)→Glicina (AA neutro). Nell’esone 4 la mutazione c→a determina, a livello proteico, una sostituzione dell’amminoacido basico Istidina (H) con Asparagina (N), molecola neutra. Il profilo dell’esone 6 evidenzia la sostituzione di base a→g in una porzione intronica tra l’esone 6 e 7, questo sito risulta di minor interesse rispetto agli altri perché non viene espresso. E’ stato infine analizzato l’effetto delle mutazioni trovate a livello dell’esone 4 e dell’esone 13 sulle proprietà elettrofisiologiche e sulla localizzazione cellulare. Questi esperimenti sono stati condotti presso il laboratorio del Prof. E. Wanke (Università di Milano Bicocca). Dall’analisi delle proprietà biofisiche della corrente mediata dai canali codificati dai plasmidi mutagenizzati, è emerso che tutte le correnti mediate dai mutanti presentano uno slittamento della curva di attivazione verso valori più iperpolarizzati. In cellule neuronali, dove queste proteine sono in grado di regolare la frequenza di scarica, ciò potrebbe influenzare le proprietà biofisiche alla base dell’eccitabilità cellulare.
- XX Ciclo
- 1976
Date
- 2008-04-22T15:36:28Z
- 2008-04-22T15:36:28Z
- 2008-03-13
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-5797