- Studio dei cluster genici responsabili della produzione di cepaciano in isolati clinici di Burkholderia cepacia
- Furlanis, Linda
Subject
- Burkholderia Biosintesi dell' esopolisaccaride Cepaciano Cluster Genici
- FARMACOLOGIA, CHEMIOTERAPIA E MICROBIOLOGIA
- MED/07 MICROBIOLOGIA E MICROBIOLOGIA CLINICA
Description
- 2007/2008
- Nel corso degli anni ’80, nei pazienti affetti da fibrosi cistica, si è verificato un aumento dell’incidenza delle infezioni polmonari da parte di Burkholderia cepacia, microrganismo che fino a quel periodo era considerato esclusivamente un fitopatogeno. In alcuni dei pazienti in questione le infezioni provocate si sono dimostrate gravi, correlate ad un rapido deterioramento delle funzioni polmonari, talvolta con esito fatale (sindrome da cepacia). Da allora l’interesse in campo clinico per questo batterio è molto aumentato e numerosi studi hanno rivelato diversi nuovi aspetti di questo patogeno. E’ stata, infatti, riscontrata un’evidente variabilità interna alla specie, che è stata correlata a differenti implicazioni dal punto di vista clinico, sia per quanto riguarda la trasmissibilità dell’infezione sia per la sua evoluzione. Si è quindi supposto che all’interno della stessa specie possano venire espressi fattori di patogenicità differenti, per cui certi ceppi di B. cepacia, definiti epidemici, si trasmettono con più facilità da paziente a paziente. Per limitare le infezioni tra i pazienti affetti da fibrosi cistica, in vari centri si è tentato di segregare coloro che risultano positivi all’esame colturale per B. cepacia. Ciò ha determinato nei confronti del paziente problematiche di ordine gestionale e psicologico. Per questo motivo vari studi stanno cercando di individuare i principali fattori di patogenicità del microrganismo, per poter limitare la segregazione solo ai pazienti infettati da ceppi effettivamente pericolosi. A questo proposito si è rivolta l’attenzione allo studio dell’esopolisaccaride (EPS) prodotto da alcuni ceppi di B. cepacia, che potrebbe giocare un ruolo simile a quello svolto dall’alginato prodotto da Pseudomonas aeruginosa, determinante sia nell’instaurarsi dell’infezione, sia nel suo mantenimento, poiché rende il microrganismo resistente alla risposta immunitaria e all’azione degli antibiotici grazie alla formazione di biofilm. Nel caso di Pseudomonas, i sistemi di regolazione che controllano la produzione di EPS e che favoriscono la comparsa di fenotipi mucoidi nel polmone del paziente fibrotico sono noti da tempo. Per quel che riguarda Burkholderia è documentato l’isolamento di ceppi che alternano l’espressione del fenotipo mucoide e di quello non mucoide, anche se i fattori responsabili del passaggio dall’uno all’altro non sono ancora chiariti. Nel presente studio si sono voluti identificare i geni responsabili della produzione dell’EPS nel ceppo BTS2, isolato dall’espettorato di un paziente affetto da fibrosi cistica, e studiare i meccanismi che ne regolano l’espressione. Per questo motivo, è iniziato lo studio del locus genico responsabile della produzione di cepaciano, l’EPS più comune prodotto da B. cepacia, costituito da un’unità ripetuta eptamerica ramificata, nella quale sono presenti 5 diversi monosaccaridi. Il locus in questione è stato individuato nel ceppo di isolamento clinico BTS2 e totalmente sequenziato (23 Kb), permettendo di identificare 16 geni codificati. Per fare questo è stata utilizzata la tecnica della transposon mutagenesis che ha permesso di individuare un gene, l’UDP-Glucosio deidrogenasi (ugdh), indispensabile per la produzione del cepaciano. Si è quindi dimostrata, mediante appositi test in vitro, la produzione di acido glucuronico da parte del gene ugdh, confrontando la sua espressione nel ceppo wild-tipe rispetto a quello in cui il gene era stato inattivato per transposon mutagenesis. Nel tentativo di dimostrare che questo locus fosse indispensabile per la sintesi dell’EPS si è cercato di esprimere il polisaccaride in opportuni riceventi non mucodi. Purtroppo dagli esperimenti di complementazione non è stato possibile evidenziare il ripristino del fenotipo mucoide; ciò, assieme ad uno studio in silico più approfondito dei geni del locus rispetto la struttura dell’eptasaccaride e l’ipotesi di una via metabolica per la sintesi del polisaccaride, ci ha portato a considerare il fatto che questa regione non fosse sufficiente alla sintesi di EPS. Abbiamo quindi ripreso in considerazione alcuni cloni precedentemente congelati ottenuti dalla transposon mutagenesis, esperimento che ci ha permesso di individuare il primo locus genico. Dall’analisi di uno di questi è emerso un nuovo gene coinvolto nella sintesi di EPS ovvero un omologo del gene wzx di E. coli, che dovrebbe permettere lo spostamento nello spazio periplasmico dell’unità eptamerica, precedentemente formata nel citoplasma, dove successivamente verrà ulteriormente polimerizzata e trasportata all’esterno. Studi approfonditi sulla funzione di questo gene sono attualmente in corso. Contemporaneamente è stata effettuata un’analisi in silico della regione adiacente al nuovo gene identificato all’interno del genoma di un ceppo di riferimento, Burkholderia sp. 383, disponibile in banca dati. Questo studio ci ha permesso di ipotizzare il coinvolgimento di una nuova regione lunga circa 15 Kb e contenente 9 geni, dei quali è stata ipotizzata la funzione. Allo scopo di sequenziare il nuovo locus nell’isolato BTS2 è stata costruita una sonda per il gene wzx con la quale è stata screenata la banca genica già in nostro possesso. Abbiamo ottenuto alcuni cloni positivi che sono stati sequenziati fino ad ottenere la sequenza completa, che è risultata essere differente in alcune regioni rispetto al ceppo di riferimento Burkholderia sp. 383 in quanto sono presenti due transposasi inserite al livello dei geni codificanti per le aciltransferasi. A questo proposito è stato analizzato il pattern di acetilazione dei diversi isolati clinici sia dal punto di vista genico, sia per quanto riguarda la composizione del polisaccaride, poiché livelli diversi di acetilazione potrebbero modificare la viscosità dell’EPS prodotto. Oltre a ciò sono stati studiati 2 geni che probabilmente sono implicati nella sintesi del D-Ramnosio, monomero indispensabile per la costruzione dell’EPS cepaciano, molto raro in natura, e non presente in commercio. Questi geni sono stati clonati e fatti esprimere nel ceppo ricevente verificando la produzione dello zucchero mediante test spettrofotometrico. Allo scopo di chiarire quali siano i fattori che influenzino l’espressione del fenotipo mucoide rispetto a quello non mucoide, sono stati identificati nel locus 1 alcuni geni di regolazione della trascrizione, mai descritti finora, che sono stati confrontati in isolati clinici di Burkholderia che producono polisaccaridi a seconda del terreno su cui sono stati coltivati. L’identificazione di differenze nella regione di regolazione potrebbe spiegare come avviene il cambiamento di fenotipo da non mucoide a mucoide nel polmone dei pazienti FC, come accade per Pseudomonas aeruginosa, e potrebbe chiarire il conseguente peggioramento del decorso clinico. Numerosi tentativi volti ad amplificare questa regione da diversi isolati per ottenere la sequenza non hanno dato i risultati sperati. Questo ha fatto ipotizzare che si tratti di una regione poco conservata, il cui studio doveva essere affrontato utilizzando un approccio più complesso. In questo modo siamo riusciti a verificare che l’organizzazione dei geni presenti in questa regione terminale è diversa in isolati clinici con diversa capacità di produrre cepaciano. Inoltre per confermare il coinvolgimento di questa regione nel controllo della produzione di EPS si sta allestendo un esperimento di mutagenesi sito specifica che permetta di inattivare selettivamente i geni da indagare.
- XXI Ciclo
Date
- 2009-04-27T11:06:00Z
- 2009-04-27T11:06:00Z
- 2009-03-02
- 1981
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-7361