- Mechanism involved in the UCB neurotoxicity on cellular models
- Meccanismo coinvolto nel danno neurotossico da bilirubina in modelli cellulari
- Giraudi, Pablo Jose'
Subject
- bilirubin neurotoxicity
- neuroblastoma cells
- cystine/glutamate transporter
- SCIENZE BIOMOLECOLARI
- BIO/10 BIOCHIMICA
Description
- 2007/2008
- Summary This doctoral thesis covers three years period (2006-2008) during which I have investigated the bilirubin neurotoxicity in the neuroblastoma SH-SY5Y cell line, a neuronal cell model widely used in the study of the pathogenesis and in the development of new therapeutic compounds for neurodegenerative diseases. In the first chapter is summarized the current knowledge about bilirubin chemistry and metabolism including disorders of bilirubin metabolism and the neuronal disturbances associated. In addition, the main discoveries in bilirubin toxicity mechanisms are described. Chapter two describes how we have chosen the cellular model to study the unconjugated bilirubin (UCB) damage. We first compared the bilirubin accumulation and cell viability in two neuronal cell lines (2a1 mouse neuronal progenitor cell line and SH-SY5Y cell line) and one non neuronal cell line (HeLa cells). In addition, we performed studies on cellular localization of Mrp1 (involved in UCB extrusion) and mRNA expression. We observed that SH-SY5Y cells show higher accumulation of bilirubin and lower survival than 2a1 and HeLa cells. SH-SY5Y cells shows a clear localization of Mrp1 at membrane level. Based on these observations we selected the SH-SY5Y cell line as our experimental model, and we characterized this cell line for molecular events linked with bilirubin neurotoxicity. Chapter three revises original data published by mainly our group, about “the free bilirubin hypothesis”. It has been suggested that cell injury correlates better with free unconjugated bilirubin (Bf) than total unconjugated bilirubin (BT). To directly test this hypothesis we evaluated cell viability in four cell lines (SH-SY5Y, MEF, HeLa and 2a1 cell lines) after incubation with different Bf/BT ratios, obtained by mixing varied UCB concentrations and albumins with different binding affinities (bovine, fetal calf and human); Bf was measured in each solution by the peroxidase method. Our data show that the loss of viability is dependent on the Bf but not on BT although bilirubin sensitivity varied with the different cell line tested. This in vitro study reinforces the proposal that Bf or Bf combined with total serum bilirubin should improve risk assessment for neurotoxicity in both term and premature infants. Chapter four describes our studies about the biochemical and molecular changes in SH-SY5Y cells exposed to a rather high Bf (140 nM) for 24 hours. Biochemical changes (cell viability, proliferation, cellular redox environment -ROS and GSH content) and gene expression profile were evaluated in the cells which survived after the treatment. Results suggest that the surviving cells become more resistant to a second oxidative exposition (Bf or H2O2) and this was associated with an increases expression of various genes involved both in ER stress response and in the transport system Xc- (cystine-glutamate exchanger). This transport system is of great relevance in maintaining the redox homeostasis within the cell, and together with the ER stress genes may contribute to the activation of an adaptative response to bilirubin damage. Further studies will be necessary to elucidate the molecular mechanisms that confer resistance to bilirubin toxicity; these mechanisms could help understanding the different sensitivity of the cells to bilirubin damage, and why some neuronal cells die (as the Purkinje cells) while others don’t. Furthermore, these studies may achieve to the identification of target proteins useful to develop new drugs: this may be the case of the system Xc-.
- Riassunto Questo lavoro di tesi è il frutto delle ricerche svolte nei tre anni del mio dottorato (2006-2008), durante i quali mi sono occupato dello studio della neurotossicità da bilirubina nella linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y; si tratta di un modello cellulare neuronale ampiamente utilizzato nello studio della patogenesi di malattie neurodegenerative, nonché nello sviluppo di composti neuroprotettivi. Nel primo capitolo si trovano riassunte le conoscenze attuali riguardanti la chimica della bilirubina, il suo metabolismo ed eventuali disordini ed i disturbi neuronali associati ad essa; inoltre, sono descritte le principali scoperte sui suoi meccanismi di tossicità. Nel secondo capitolo viene descritta come è stata effettuata la scelta di un modello cellulare adeguato allo studio del danno da bilirubina non coniugata (UCB). A questo scopo sono stati confrontati l’accumulo in bilirubina triziata e la vitalità cellulare dopo un trattamento con bilirubina libera, in due linee cellulari neuronali (progenitori neuronali di striato di topo -cellule 2a1- , neuroblastoma umano -cellule SH-SY5Y-) ed in una linea cellulare non neuronale (cellule HeLa). Oltre a ciò, sono stati eseguiti alcuni studi sulla localizzazione del trasportatore Mrp1 (coinvolto nell’estrusione di UCB), e sull’espressione dei geni Mrp1 ed Mdr1 (il cui prodotto proteico è un possibile trasportatore di bilirubina). Abbiamo osservato che le cellule SH-SY5Y presentano un accumulo di bilirubina più elevato ed una più bassa sopravvivenza rispetto alle cellule 2a1 ed HeLa, sebbene nelle cellule SH-SY5Y la localizzazione di Mrp1 risulti essere a livello di membrana plasmatica. Basandoci su queste osservazioni abbiamo scelto di lavorare con il modello cellulare già noto SH-SY5Y, e ci siamo occupati di caratterizzarlo per la neurotossicità da bilirubina. Nel terzo capitolo vengono presentati dati sperimentali pubblicati dal nostro gruppo a supporto dell’ “ipotesi della bilirubina libera”, la quale postula che il danno cellulare da bilirubina correli in modo migliore con la concentrazione di bilirubina libera (Bf) piuttosto che con quella di bilirubina totale (BT). Al fine di testare quest’ipotesi abbiamo valutato la vitalità in quattro diverse linee cellulari (SH-SY5Y, MEF, HeLa e 2a1) dopo aver incubato le cellule in soluzioni con un diverso rapporto Bf/BT. Tali soluzioni sono state ottenute sciogliendo diverse quantità di UCB in terreno con diversi tipi di albumina (bovina, umana e di siero fetale bovino); questi binders possiedono differenti affinità per la bilirubina. La Bf è stata determinata in ciascuna soluzione utilizzando il metodo della perossidasi. I dati ottenuti suggeriscono che, sebbene la sensibilità alla bilirubina vari nelle diverse linee cellulari, la riduzione in vitalità dipenda dalla Bf e non dalla BT. Quindi, questi studi in vitro costituiscono un’evidenza in più a favore della teoria della bilirubina libera, e sostengono la necessità di valutare il rischio di Kernittero mediante la misura della Bf serica e non solo della bilirubina totale. Nel quarto capitolo si descrivono le modificazioni a livello biochimico e molecolare nella linea cellulare SH-SY5Y dovute ad un trattamento di 24 ore in presenza di un’elevata concentrazione di bilirubina libera. Nelle cellule sopravvissute al trattamento abbiamo valutato diversi parametri biochimici tra cui vitalità e proliferazione cellulare ed ambiente redox cellulare (contenuto di ROS e GSH), nonché il pattern di espressione genica indotto dalla bilirubina. I risultati ottenuti suggeriscono che le cellule SH-SY5Y sopravvissute siano più resistenti all’esposizione ad un secondo stress ossidativo (Bf o H2O2), inoltre queste cellule mostrano un’aumentata espressione di diversi geni coinvolti nella risposta allo stress di reticolo endoplasmatico e dei geni i cui prodotti proteici fanno parte del sistema di trasporto Xc- (antiporto cistina-glutammato). Questo sistema di trasporto è estremamente importante nel mantenimento dell’omeostasi redox cellulare, ed insieme ai geni dello stress di ER potrebbe contribuire all’attivazione di una risposta adattativa al danno da bilirubina. Ulteriori studi che ci consentano di comprendere i meccanismi molecolari che conferiscono resistenza alla neurotossicità da bilirubina potrebbero aiutarci a capire la differenza di sensibilità dei diversi tipi di cellule alla bilirubina stessa, ed il motivo per cui alcune cellule neuronali muoiano (come ad esempio le cellule di Purkinje) mentre altre no. Inoltre questi studi possono portarci all’identificazione di target proteici utili allo sviluppo di nuovi farmaci, quale può essere ad esempio il caso del trasportatore Xc-.
- XXI Ciclo
- 1978
Date
- 2009-04-28T12:11:44Z
- 2009-04-28T12:11:44Z
- 2009-03-02
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-7372