- Studi strutturali di sistemi proteici e supramolecolari - studi sulla fosfodiesterasi umana,sulla proteasi da HIV-1 e su nuove classi di resorcinareni
- Structural studies on proteic and supramolecular systems - Studies on human phosphodiesterase, on HIV-1 protease and on new resorcinarene classes
- Demitri, Nicola
Subject
- Cristallografia
- HIV-1 proteasi
- Structure Based Drug Design
- Carbamilazione
- Fosfodiesterasi umana
- Chimica supramolecolare
- Polimero supramolecolare
- Cavitando chirale
- SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE E TECNOLOGIE CHIMICHE E FARMACEUTICHE
- CHIM/03 CHIMICA GENERALE E INORGANICA
Description
- 2008/2009
- Durante i tre anni della Scuola di Dottorato in Scienze e Tecnologie Chimiche e Farmaceutiche, il Dott. Demitri Nicola si è dedicato ad un progetto di ricerca riguardante lo studio strutturale mediante diffrazione di raggi-X di diversi sistemi proteici e complessi supramolecolari. I progetti di studio sviluppati in questi tre anni di ricerca hanno riguardato: 1. Studi strutturali di complessi della proteasi da HIV-1 con nuovi inibitori. Questo enzima è un target d’elezione nel structure based drug design e nella terapia antiretrovirale attualmente adottata per il trattamento dell’AIDS. La messa a punto dei protocolli di espressione della proteina ricombinante in sistema E. coli e delle tecniche di purificazione cromatografiche ha garantito livelli di concentrazione e purezza della proteina, adeguati a fornire cristalli di dimensioni adatte agli esperimenti di diffrazione di raggi-X per lo studio strutturale mediante tecniche biocristallografiche dell’enzima in complesso con tre diversi inibitori: il farmaco commerciale, Saquinavir (SQV), e due nuove molecole sintetiche (FT99 ed EPX). Dati strutturali ad alta risoluzione di una nuova forma cristallina del complesso PR/SQV sono stati ottenuti ed hanno mostrato la presenza di disordine dell’inibitore nel sito catalitico, permettendo di discutere del fenomeno, anche in relazione ai dati strutturali già presenti in letteratura. È stata inoltre riscontrata la carbamoilazione della prolina N-terminale della proteina causata dall’utilizzo di urea come agente caotropico e ciò rappresenta la prima evidenza strutturale di tale fenomeno. Sono stati anche studiati due nuovi inibitori sviluppati nel laboratorio della Prof. Funicello (Università Degli Studi della Basilicata) e nel laboratorio del Prof. Benedetti (Università Degli Studi di Trieste): FT99 è un inibitore reversibile basato su uno scaffold sulfonammidico, mentre EPX è un isostere Phe-Phe, basato su una funzionalità epossidica e quindi disegnato per legare covalentemente la proteina ed agire come inibitore irreversibile. Cocristallizzando la proteasi con FT99 si è riscontrata l’assenza dell’inibitore nel sito catalitico (nei cristalli analizzati) e ciò può essere correlato alla relativa bassa affinità di questo inibitore per l’enzima. I dati strutturali sono stati comunque utili per indagare sulla struttura della apoproteina e per suggerire delle modifiche che portino a migliorie delle proprietà inibitorie di questo lead compound. Le mappe di densità elettronica, ottenute dai dati diffrazione del complesso PR/EPX, cristallizzato a pH 6, hanno mostrato il sito catalitico occupato in modo ordinato dall’inibitore che possedeva l’anello epossidico intatto. Questo risultato è particolarmente interessante vista l’elevata reattività che il gruppo funzionale epossidico normalmente manifesta. Per verificare questa reattività si è provato ad innescare la reazione di apertura dell’anello direttamente nel cristallo del complesso PR/EPX aumentando a 9 il pH mediante diffusione di ammoniaca. L’alterazione del pH non ha mostrato un danneggiamento dei cristalli ed il modello strutturale ottenuto dai dati di diffrazione raccolti ha mostrato che l’inibitore reagisce aprendo l’anello epossidico in modo stereospecifico per addizione di ammoniaca. 2. Espressione e purificazione della fosfodiesterasi umana PDE4B2, volta alla caratterizzazione strutturale di complessi di questo enzima con nuovi inibitori. Quest’attività di ricerca è stata condotta in collaborazione con la Chiesi Farmaceutici e con il laboratorio diretto dal Dott. Gianluca Tell dell’Università degli Studi di Udine. Le PDE hanno un ruolo fondamentale nelle patologie infiammatorie (come asma, psoriasi e dermatite allergica), e lo sviluppo di farmaci specifici in grado di regolare selettivamente l’attività di questi enzimi è particolarmente rilevante per lo sviluppo di nuovi farmaci antinfiammatori. All’inizio è stata svolta una ricerca bibliografica per conoscere le strutture e le sequenze primarie delle proteine PDE4 già cristallizzate, presenti in letteratura. Ciò ha permesso di evidenziare la sequenza del dominio catalitico della variante PDE4B2 adatta alla cristallizzazione. Scelta la sequenza da esprimere, nel laboratorio del Dott. Gianluca Tell è stato prodotto il plasmide contenente il gene della proteina scelta. Inizialmente si è deciso di provare ad usare il vettore di espressione pGEX-2T, col quale ci si è concentrati sulla purificazione della proteina di fusione GST-PDE4B2. Avendo riscontrato diverse problematiche nella purificazione di questo costrutto, si è deciso di passare all’espressione e purificazione del dominio catalitico della proteina PDE4B2 fusa con l’(His)6Tag. Purtroppo, dopo aver messo a punto un protocollo per la purificazione in condizioni denaturanti, non si è riusciti ad ottenere cristalli di proteina adatti agli studi tramite diffrazione di raggi X. Il progetto è rimasto perciò aperto ad ulteriori sviluppi, mirati al completamento della caratterizzazione strutturale, cercando nuovi approcci di purificazione della proteina in condizioni denaturanti e nuovi protocolli di purificazione che non prevedano l’uso di agenti caotropici. 3. Determinazione strutturale di sistemi supramolecolari di cavitandi chirali e non, funzionalizzati al bordo superiore con gruppi fosfonici e tiofosfonici. Quest’attività di ricerca è stata condotta in collaborazione con il gruppo del Prof. Dalcanale del Dipartimento di Chimica Organica e Industriale dell’Università di Parma. I sistemi supramolecolari in linea generale sono caratterizzati da specifiche interazioni host/guest. Il fatto che tali legami siano non-covalenti rappresenta uno dei punti di forza per questo tipo di recettori, in quanto alla base del riconoscimento molecolare c’è la possibilità di poter correggere il complesso host/guest attraverso la facile rottura e formazione di interazioni deboli. Questi sistemi sono utilizzabili come recettori, sensori di massa e dynamer, nuovi materiale interessanti dal punto di vista tecnologico, costituito da componenti modulari, di dimensioni nanometriche, capaci di rispondere a stimoli esterni. Durante questo dottorato sono stati analizzati due sistemi molto diversi. Il primo di questi è una specie capace di auto assemblare per dare spontaneamente origine a polimeri supramolecolari. La caratterizzazione di questo monomero resorcinarenico allo stato solido conferma la capacità che ha questo in soluzione di dare polimeri lineari (peculiarità confermata da misure NMR e SLS). La molecola ha mostrato di poter autoassemblare in catene polimeriche le quali si affiancano in modo ordinato allo stato solido. L’altra molecola analizzata (2PO1PSME) è un cavitando chirale utilizzabile come recettore o sensore di massa, per alcoli chirali. Lo studio di questa specie è passato attraverso una fase di messa a punto di un protocollo di purificazione del composto racemo, tramite cromatografia di affinità ottenuta per funzionalizzazione di una resina con l’amminoacido naturale treonina. La successiva caratterizzazione mediante diffrazione a raggi-X del cavitando chirale, seppur ottenuta in forma racemica, ha permesso di ottenere le caratteristiche strutturali di questo promettente recettore chirale.
- XXII Ciclo
- 1981
Date
- 2010-06-16T10:32:29Z
- 2010-06-16T10:32:29Z
- 2010-03-26
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-8832