• Use of Tn5-transposon mutagenesis for the identification of potential novel interactors of antimicrobial peptides in E.coli
  • Bociek, Karol

Subject

  • antimicrobial peptides
  • LL-37
  • transposon mutagenesis
  • antibiotic resistance
  • LPS
  • SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
  • BIO/10 BIOCHIMICA

Description

  • 2008/2009
  • Antimicrobial peptides (AMPs) participate in the immunity of both animals and plants. In mammals, the most important AMP families are defensins and cathelicidins. The only human cathelicidin, LL-37, is a 37-residue, α-helical, cationic peptide with a direct membranolytic antibacterial activity and various immunomodulatory activities. The aim of our research was to establish a procedure based on an E. coli knock-out mutant library in the search for mutations conferring altered susceptibility to AMPs. The library was created by random insertions of Tn5 transposon into the bacterial genome. The selection of low-susceptibility mutants and their identification was first tested with a Bac7-derived peptide, for which at least one interactor had been found. The procedure was then applied for the identification of mutations that modulate the susceptibility of E. coli cells to LL-37 with the aim of dissecting the steps of the peptide's mode of action. The differences between the wild-type and the mutant phenotypes were characterised using assays determining the bacterial culture growth inhibition and killing, as well as cell binding and membrane permeabilisation. In the majority of the isolated Bac7-resistant mutants, Tn5 was inserted in the sbmA gene, confirming previous findings that showed an essential role for the SbmA protein in the internalisation of Bac7, allowing it to exert its antimicrobial activity. Tn5 insertion in the gene waaY, identified in 15 out of 20 resistant mutants selected with LL-37, lowered the peptide’s ability to inhibit bacterial growth and to kill cells, decreased peptide binding to the bacterial surface and membrane permeabilisation. However, it did not alter the susceptibility to other AMPs. WaaY encodes a specific kinase that phosphorylates the Hep II residue in the core region of bacterial lipopolysaccharide. The inactivation of this enzyme determines a decreased negative charge of the outer membrane, which in turn causes a decrease in the peptide’s binding to the cell surface and in its antibacterial activity. The results reveal a putative LPS-binding site for LL-37 and stress the importance of its initial binding to the cell surface for antimicrobial efficacy. The established procedure utilising Tn5 mutants in the search for bacterial mutations conferring resistance to AMPs, proved efficient and opened a previously unreported branch of research on the mode of action of the human cathelicidin.
  • I peptidi antimicrobici (AMP) fanno parte dell'immunità innata sia degli animali che delle piante. Le famiglie di AMP più importanti nei mammiferi sono le defensine e le catelicidine. L'unica catelicidina presente nell'uomo, LL-37, è un peptide lineare e cationico di 37 residui con una conformazione ad α-elica, che esercita un’azione microbicida diretta tramite permeabilizzazione di membrana. In aggiunta, il peptide è anche dotato di una serie di funzioni immunomodulatorie. Lo scopo del lavoro è stato quello di mettere a punto una procedura che utilizza una libreria di mutanti knock-out di E. coli, ottenuta mediante inserzioni casuali del trasposone Tn5 nel genoma batterico, per cercare mutazioni che rendano i batteri resistenti agli AMP. La bontà del metodo è stata prima verificata selezionando e identificando mutanti resistenti al frammento 1-16 del peptide Bac7. Una volta ottenuti i risultati attesi, la procedura è stata applicata all'identificazione di mutazioni che modulino la suscettibilità di E. coli a LL-37, con lo scopo di meglio comprenderne il meccanismo d'azione. I fenotipi wild-type e mutante sono stati caratterizzati usando saggi d'inibizione della crescita batterica, di killing e di capacità del peptide di legarsi ai batteri e di permeabilizzarli. Nella maggioranza dei mutanti resistenti al peptide Bac7 isolati, Tn5 ha inattivato il gene sbmA, confermando risultati precedenti che avevano portato a dimostrare l'importanza della proteina SbmA per l'internalizzazione di Bac7. Nel caso di LL-37, in 15 dei 20 mutanti resistenti selezionati il trasposone ha inattivato il gene waaY, che codifica per una chinasi specifica per la fosforilazione del residuo Hep II della regione core del lipopolisaccaride batterico. La mancata fosforilazione nei mutanti selezionati riduce la carica negativa della superficie batterica, che, a sua volta, diminuisce l'inibizione della crescita, il killing, il legame e la permeabilizzazione delle cellule da LL-37, ma non da altri peptidi, suggerendo che la modificazione abbia alterato specificamente l'attività di LL-37, rivelando un suo putativo sito di legame all’LPS e sottolineando l'importanza del legame iniziale alla superficie cellulare per l'efficacia battericida del peptide. La procedura messa a punto per la ricerca di mutazioni che inducono resistenza agli AMP è risultata efficiente ed ha indicato una nuova via per far luce sulla sequenza di eventi responsabile del meccanismo d'azione della catelicidina umana.
  • XXII Ciclo
  • 1982

Date

  • 2010-07-23T12:49:16Z
  • 2011-05-31T09:31:59Z
  • 2010-04-26

Type

  • Doctoral Thesis

Format

  • application/pdf

Identifier

http://hdl.handle.net/10077/3619

urn:nbn:it:units-8945