• Identification of tissue transglutaminase protein network
  • Sulic, Ana-marija

Subject

  • ''tissue transglutaminase''
  • interactome
  • ''phage display''
  • ''massive sequencing''
  • ''protein-protein interaction''
  • SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NEUROSCIENZE E SCIENZE COGNITIVE
  • BIO/18 GENETICA

Description

  • 2009/2010
  • Tissue transglutaminase (TG2) is a multifunctional enyzme involved in cell growth and differentiantion, receptor mediated endocytosis, cell adhesion and morphology, stabilization of extracellular matrix, membrane trafficking and structure/function, signal transduction, regulation of cytoskeleton and apoptosis. Multiple lines of evidence suggest an involvement of TG2 autoimmune diseases, cancer and in neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease, progressive supranuclear palsy, Huntington's disease and Parkinson's disease. In all of the neurodegenerative diseases examined to date, TG2 activity is upregulated in selectively vulnerable brain regions, TG2 proteins are associated with inclusion bodies characteristic of the diseases, and prominent proteins in the inclusion bodies are modified by TG2 enzyme. It is important to identify TG2 substrates as they may offer an understanding of how the TG2-catalyzed post-translational modification has an impact on physiology and disease. Identification of these substrates may lead to novel drug targets and new diagnostic markers for several TG2-related diseases. A variety of different methods have been proposed for the identification of TG2 substrates. In this work we applied a new method for identification of TG2 substrates (interactors) by using a selection of cDNA phage display libraries followed by massive gene sequencing with 454 system. Ranking and analysis of more than 120,000 sequences allowed us to identify several potential substrates and interactors, which were subsequently confirmed in functional assays. Within the identified clones, some had been previously described as interacting proteins (fibronectin, SMOC1, EIF4G2, MYO18A, GSTO2), while others were new. When compared to standard systems, such as microtiter ELISA, the method described here is dramatically faster and yields far more information about the interaction under study, allowing better characterization of complex systems. For example, in the case of fibronectin, it was possible to identify the specific domains involved in the interaction. We expect that this approach to library and selection analysis can also be extended to other methods traditionally used to study protein-protein interactions, as well as to the study of the selection of peptides and antibodies by phage display.
  • L'enzima transglutaminasi tissutale è un enzima multifunzionale. Questa proteina gioca un ruolo importante durante lo sviluppo, crescita e differenziamento cellulare, endocitosi mediata da recettore, adesione e morfologia cellulare, stabilizzazione della matrice extracellulare, traffico e struttura/funzione di membrana, trasduzione del segnale, regolazione del citoscheletro ed apoptosi. Molteplici evidenze indicano un coinvolgimento di TG2 in diverse patologie neurodegenerative, incluso il morbo di Alzheimer, la paralisi progressiva supranucleare, il morbo di Huntington e quello di Parkinson. In tutte le malattie neurodegenerative esaminate finora, l'attività della TG2 è aumentata in specifiche regioni cerebrali e le proteine sono associate in corpi d’inclusione caratteristici di tali patologie dove vengono modificate dall'enzima TG2. E’ importante identificare i substrati della TG2 per comprendere come le modifiche post-traduzionali introdotte da questo enzima siano coinvolte nella patogenesi delle suddette malattie. Molteplici metodiche sperimentali sono state proposte ai fini dell'identificazione dei substrati della TG2. In questo lavoro è stato applicato un nuovo metodo per l’identificazione dei substrati della TG2 (interattori), selezionando una libreria di cDNA espressa come phage display, seguito da un sequenziamento genico massivo utilizzando il sistema 454 Life Sciences. La classificazione e l’analisi di più di 120,000 sequenze di DNA ha permesso di identificare molti substrati e potenziali interattori, che sono stati successivamente confermati con le analisi funzionali. All’interno dei cloni identificati, alcuni erano già stati precedentemente descritti come proteine interagenti (interattori) (fibronectina, SMOC1, EIF4G1, MYO18A, GSTO2), mentre altri sono stati identificati come nuovi. Nella comparazione con i metodi standard, come, ad esempio, ELISA, il metodo qui descritto risulta enormemente più rapido e fornisce un numero molto maggiore di informazioni relative alle interazioni analizzate, permettendo quindi una migliore caratterizzazione di sistemi complessi. Ad esempio, nel caso della fibronectina, è stato possibile identificare i domini specifici coinvolti nell’interazione. Prevediamo che questo approccio per l’analisi e la selezione di librerie, possa essere applicato anche ad altri metodi tradizionalmente usati per lo studio di interazioni proteina- proteina, così come allo studio di selezioni di peptidi e anticorpi tramite la tecnica del phage display.
  • XXIII Ciclo
  • 1979

Date

  • 2011-05-10T09:59:04Z
  • 2011-05-10T09:59:04Z
  • 2011-03-15

Type

  • Doctoral Thesis

Format

  • application/pdf

Identifier

http://hdl.handle.net/10077/4484

urn:nbn:it:units-8987