- Post-translational modifications and conformational transitions of the intrinsically disordered oncoproteins High-Mobility Group A
- Modificazioni post-traduzionali e transizioni conformazionali delle oncoproteine intrinsecamente disordinate high-mobility group A
- Maurizio, Elisa
Subject
- oncogenic protein
- protein conformation
- phosphorylation
- mass spectrometry
- ion mobility separation-mass spectrometry
- SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOMEDICINA MOLECOLARE
- BIO/10 BIOCHIMICA
Description
- 2009/2010
- Intrinsically disordered proteins (IDPs) are flexible molecules, able to adapt to the surfaces of different molecular partners by means of specific, but easily reversible interactions. IDPs carry out pivotal biological functions participating in almost all cell signaling and regulatory pathways. Importantly, IDPs activities are finely modulated by the addition/removal of numerous post-translational modifications (PTMs) which are important conformational modulators. Prototypes of IDPs are High Mobility Group A (HMGA) proteins, which are expressed at high levels and play essential functions both in embryonic and cancer cells. HMGA protein family (HMGA1a, HMGA1b, and HMGA2) belong to the non-histone HMG chromatin protein super-family and are multifunctional architectural transcription factors. HMGA conformational adaptability and intricate pattern of dynamic and constitutive PTMs are thought to be responsible for this multifunctionality. We performed a liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) screening in twenty different cell lines in order to evaluate HMGA proteins PTM pattern and we evidenced relevant intra-family differences. Moreover, we focused on the poorly characterized HMGA2 and we mapped HMGA2 phosphorylation sites by mass sequencing demonstrating that, similarly to HMGA1, it is phosphorylated on the acidic C-terminal tail by CK2. Importantly, this modification turned out to affect HMGA2 DNA binding. Since truncated HMGA proteins are more oncogenic than full-length ones and since HMGA are in vivo heavily modified on their C-terminal domain, we dissected the role of this domain and its phosphorylations from a structural point of view. We probed HMGA IDPs compactness and accessibility taking advantage of an innovative approach combining limited proteolysis and MS-based techniques. By limited proteolysis, ESI (electrospray ionization)-MS, and IMS (ion mobility separation)-MS we demonstrated that HMGA can assume a compact conformation and that their compactness degree is dependent upon the presence of the acidic C-terminal domain and its constitutive phosphorylations. Moreover, LC-MS analyses after enzymatic assays showed that HMGA forms with a deletion of acidic C-terminal tail are more susceptible to PTMs, thus supporting the idea that the acidic tail is involved in masking the accessibility of modifying enzymes to their own consensus sites. We evidenced macroscopic differences regarding PTMs affecting the three HMGA family members and provided the first data about in vivo HMGA2 PTMs and their effect on DNA binding. Our structural investigations revealed a structure/PTMs relationship dictated by the presence of the C-terminal domain. This evidence, together with the already known in vivo functional outcome of HMGA C-terminal truncation, suggests a structure/function link between HMGA tails, their PTMs, and their oncogenic properties, paving the way for the development of interfering therapeutic strategies based on targeting HMGA proteins.
- Le proteine intrinsecamente disordinate (PID) sono molecole flessibili in grado di adattarsi alle superfici di differenti partner molecolari tramite interazioni specifiche, ma facilmente reversibili. Queste proteine compiono funzioni biologiche essenziali partecipando in quasi tutte le vie di segnalazione e regolazione cellulari. La modulazione delle loro attività avviene tramite l’aggiunta/rimozione di numerose modificazioni post-traduzionali (MPT), le quali possono comportare anche cambiamenti conformazionali. Le proteine High Mobility Group A (HMGA) sono considerate prototipo delle PID. Esse sono espresse ad alti livelli e giocano funzioni chiave sia durante lo sviluppo embrionale che durante il processo di trasformazione neoplastica. Le proteine della famiglia HMGA (HMGA1a, HMGA1b e HMGA2) appartengono alla super-famiglia delle proteine cromatiniche non istoniche HMG e sono fattori trascrizionali architetturali multifunzionali. L’adattabilità conformazionale e l’intricato pattern di MPT dinamiche e costitutive delle HMGA sono ritenute essere alla base della loro multifunzionalità. In questo lavoro di tesi è stato effettuato uno screening delle MPT a cui sono soggette le HMGA in venti linee cellulari diverse mediante analisi di cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) e si sono evidenziate rilevanti differenze tra i tre diversi membri della famiglia HMGA. Inoltre, concentrandosi sulla poco caratterizzata proteina HMGA2, abbiamo dimostrato mediante mass sequencing che, al pari della proteina HMGA1a, essa è fosforilata sul C-terminale e che tale modificazione comporta un’alterazione delle sue proprietà di legame al DNA. Diversi tipi di tumore esprimono forme tronche delle proteine HMGA mancanti del dominio acidico C-terminale. Dal momento che queste forme sono state dimostrate essere maggiormente oncogeniche rispetto alle controparti a lunghezza completa abbiamo deciso di investigare il ruolo della coda acidica e delle sue fosforilazioni da un punto di vista strutturale. La compattezza e l’accessibilità delle HMGA è stata esplorata sfruttando un approccio innovativo che combina esperimenti di proteolisi limitata e tecniche di spettrometria di massa (MS). Tramite proteolisi limitata, ESI (electrospray ionization)-MS, and IMS (ion mobility separation)-MS abbiamo dimostrato che le HMGA possono assumere una conformazione compatta e che il loro grado di compattezza è dipendente dalla presenza del dominio acidico C-terminale e delle sue fosforilazioni costitutive. Inoltre, analisi LC-MS effettuate dopo saggi enzimatici hanno mostrato come le forme delle HMGA presentanti una delezione della coda acidica C-terminale sono più suscettibili alle MPT, supportando quindi l’idea che la coda acidica sia coinvolta nel mascherare l’accessibilità degli enzimi di modificazione sui siti consensus lungo la sequenza di HMGA. In questo lavoro abbiamo evidenziato differenze macroscopiche riguardanti le MPT che interessano i tre membri della famiglia HMGA e abbiamo fornito i primi dati circa le MPT di HMGA2 in vivo e il loro effetto sul legame al DNA. Le nostre investigazioni strutturali hanno rivelato una relazione struttura/MPT dettata dalla presenza del dominio C-terminale. Questa evidenza, insieme al già noto esito funzionale in vivo della delezione del C-terminale di HMGA, suggerisce un collegamento struttura/funzione tra la coda acidica delle HMGA, le loro MPT, e le loro proprietà oncogeniche.
- XXIII Ciclo
- 1983
Date
- 2011-05-19T13:22:59Z
- 2012-04-29T04:01:23Z
- 2011-04-28
Type
- Doctoral Thesis
Format
- application/pdf
Identifier
urn:nbn:it:units-9091